樣本準(zhǔn)備階段

• 高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：由于其對 RNA 樣本的兼容性較好，能適應(yīng)部分降解或純度不太高的樣本，在樣本準(zhǔn)備時，對 RNA 提取后的純度要求相對寬松。不過，為保證獲得理想的高產(chǎn)量 cDNA，仍需盡量去除可能影響逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的雜質(zhì)，如多糖、多酚等。在面對大量樣本時，樣本的批量處理能力較強(qiáng)，可高效完成多個樣本的準(zhǔn)備工作，以滿足后續(xù)大規(guī)模實(shí)驗(yàn)對 cDNA 產(chǎn)量的需求。

• 普通逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：對 RNA 樣本質(zhì)量要求較為苛刻，通常需要高質(zhì)量、高純度且完整性好的 RNA。在 RNA 提取過程中，需更嚴(yán)格地按照操作規(guī)范進(jìn)行，以確保提取的 RNA 純度達(dá)標(biāo)（A260/A280 比值一般要求在 1.8 - 2.0 之間 ）。若樣本存在降解或純度不佳，可能導(dǎo)致逆轉(zhuǎn)錄效率低下甚至失敗，所以往往需要對提取后的 RNA 進(jìn)行更精細(xì)的質(zhì)量檢測和純化處理，以保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)順利進(jìn)行。

反應(yīng)體系配制階段

• 高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：為實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量 cDNA 合成，反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)通常會考慮加大 RNA 模板的投入量以及各反應(yīng)成分的比例。以 Thermo 的高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為例，在 20μl 反應(yīng)體系中，可加入 2μg 總 RNA ，同時配套的緩沖液、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶等試劑的用量也經(jīng)過優(yōu)化，以支持大量 RNA 的逆轉(zhuǎn)錄。此外，一些高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒會將部分試劑進(jìn)行預(yù)混，如整合為 2x RT 緩沖液混合液和 20x 酶混合液（含逆轉(zhuǎn)錄酶和 RNase 抑制劑），減少移液步驟，方便實(shí)驗(yàn)人員快速配制反應(yīng)體系，尤其適用于處理大量樣本的情況。

• 普通逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：反應(yīng)體系相對靈活，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求和樣本情況，RNA 模板的用量范圍較廣，從幾十納克到幾微克不等。各試劑成分的比例也較為常規(guī)，在配制過程中，需要實(shí)驗(yàn)人員根據(jù)說明書精確量取每種試劑，對操作的準(zhǔn)確性要求較高。而且，普通逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的試劑往往較為分散，不像高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒有較多預(yù)混形式，因此在配制反應(yīng)體系時，移液操作步驟相對較多，耗時也可能更長。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)階段

• 高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時間一般較長，如 Thermo 的高容量 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時間通常為 120 分鐘 。較長的反應(yīng)時間是為了確保在加大 RNA 模板量的情況下，逆轉(zhuǎn)錄酶能夠充分發(fā)揮作用，實(shí)現(xiàn)高效且穩(wěn)定的 cDNA 合成，從而獲得足夠量的 cDNA 產(chǎn)物。在反應(yīng)過程中，對反應(yīng)溫度和時間的控制要求嚴(yán)格，以保證逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的順利進(jìn)行和產(chǎn)物質(zhì)量。

• 普通逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：反應(yīng)時間相對靈活，部分產(chǎn)品可在較短時間內(nèi)完成逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，如一些快速逆轉(zhuǎn)錄試劑盒可在 30 - 60 分鐘內(nèi)完成。較短的反應(yīng)時間適合對時間要求較高、樣本量較小的實(shí)驗(yàn)，能夠快速獲得 cDNA 產(chǎn)物用于后續(xù)分析。不過，不同品牌和型號的普通逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在反應(yīng)時間上差異較大，實(shí)驗(yàn)人員需要根據(jù)具體產(chǎn)品的說明書來確定最佳反應(yīng)條件。